Notizia

May 17, 2024

Prima prova diretta della cellula diretta

Communications Biology volume 5, Numero articolo: 1132 (2022) Cita questo articolo 6900 Accessi 7 Citazioni 27 Dettagli metriche altmetriche I batteri producono omopoli(amminoacidi) policationici, che sono

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1132 (2022) Citare questo articolo

6900 accessi

7 citazioni

27 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

I batteri producono omopoli(amminoacidi) policationici, caratterizzati da dorsali isopeptidiche. Sebbene il significato biologico degli omopoli(amminoacidi) policationici rimanga poco chiaro, recentemente è stata focalizzata una crescente attenzione sul loro potenziale utilizzo per ottenere l'internalizzazione cellulare. Qui, per la prima volta, forniamo la prova diretta che due isopeptidi policationici batterici rappresentativi, ε-poli-l-α-lisina (ε-PαL) e ε-oligo-l-β-lisina (ε-OβL), sono stati internalizzati nelle cellule dei mammiferi mediante penetrazione diretta nella membrana cellulare e quindi diffuso in tutto il citosol. In questo studio, abbiamo utilizzato derivati ​​cliccabili ε-PαL e ε-OβL che trasportano un gruppo azidico C-terminale, che sono stati prodotti enzimaticamente e quindi coniugati con un colorante fluorescente per analizzare la localizzazione subcellulare. È interessante notare che anche le proteine ​​fluorescenti coniugate con ε-PαL o ε-OβL cliccabili sono state internalizzate nelle cellule e diffuse in tutto il citosol. In particolare, un coniugato di Cre ricombinasi con ε-PαL è entrato nelle cellule e ha mediato la ricombinazione Cre/loxP, ed è stato scoperto che ε-PαL fornisce un anticorpo IgG a lunghezza intera al citosol e al nucleo.

Gli omopoli (amminoacidi), che sono rari in natura, sono prodotti dai batteri come metaboliti secondari (Fig. 1a, b e Figura 1a supplementare). Ad oggi, sei polimeri, ε-poli-l-α-lisina (ε-PαL, 1)1,2, ε-oligo-l-β-lisina (ε-OβL, 2)3, γ-poli-l/ Sono stati identificati acido d-diamminobutirrico4,5, acido β-poli-l-diamminopropionico6, ε-poli-l-β-lisina (una nostra scoperta recente)7 e acido γ-poli-l/d-glutammico1,8. Oltre a questi polimeri lineari caratterizzati dalla struttura isopeptidica, nei batteri sono stati trovati anche due polimeri ramificati costituiti da catene dipeptidiche ripetute: acido multi-l-arginil-poli-l-aspartico (noto anche come cianoficina)9,10 e acido multi-l-diamminopropionil-poli-l-diamminopropionico11. Tra questi otto omopoli(amminoacidi), l'acido γ-poli-l/d-glutammico è l'unico esempio di isopeptide polianionico presente in natura. Gli altri sono policationici e la conoscenza delle attività antimicrobiche degli isopeptidi policationici lineari è limitata. Sebbene il significato biologico degli omopoli(amminoacidi) menzionati sopra sia sfuggito in gran parte ai ricercatori, le loro proprietà poliioniche e le strutture poliammidiche sono attualmente un'area di interesse nella scienza dei materiali biologici.

a, b Strutture chimiche di ε-PαL (1) e ε-OβL (2). Il polimero 1 costituito da 25-35 residui l-αLys è prodotto da Streptomyces albulus NBRC14147 come metabolita secondario (a). L'oligomero 2 è una sottostruttura degli ST. Tutti i composti correlati alla ST sono costituiti da d-gulosammina carbamoilata a cui sono attaccati 2 (residui 1-7 l-βLys) e la forma ammidica dell'insolito aminoacido streptolidina (streptolidina lattame). c Derivati ​​esteri ε-PαL prodotti dal ceppo NBRC14147 in questo studio. I loro C-termini sono stati esterificati con alcoli e aggiunti ai terreni di coltura. Pls ha catalizzato la polimerizzazione di l-αLys e le reazioni di esterificazione. iαK (cerchi azzurri), unità monomerica dell'isopeptide l-αLys. d La struttura chimica di R8-azide (9). Il peptide 9 è stato sintetizzato chimicamente e utilizzato come controllo CPP canonico. R (cerchi viola chiaro), unità monomerica di α-peptide l-arginina. e ε-OβL-PEG-azide (19) sintetizzato enzimaticamente da rORF19. iβK (cerchi azzurri), unità monomerica dell'isopeptide l-βLys.

A differenza degli isopeptidi con funzione sconosciuta, i peptidi standard (chiamati anche eupeptidi) con sequenze ricche di arginina e/o lisina (tipicamente 5-30 residui di aminoacidi) stanno attualmente attirando interesse per le loro attività di penetrazione cellulare nelle cellule di mammifero a causa della loro azione policationica. caratteristiche a pH fisiologico; tali eupeptidi sono chiamati peptidi penetranti nelle cellule (CPP)12,13,14,15. Sebbene siano noti anche CPP anfipatici e idrofobi, i CPP policationici sono spesso impiegati come veicoli per fornire macromolecole biologiche (carichi) nelle cellule dei mammiferi14. Le vie di internalizzazione dei CPP cationici sono esse stesse ampiamente suddivise in penetrazione diretta indipendente dall'energia ed endocitosi/macropinocitosi energia-dipendente14,15; in entrambe le vie i legami del CPP con componenti della membrana cellulare caricati negativamente (come i proteoglicani dell'eparan solfato) sono un fattore scatenante essenziale per gli eventi di internalizzazione. In contrasto con le vie di penetrazione diretta, i carichi assorbiti dall'endocitosi/macropinocitosi devono fuggire dagli endosomi al citosol per evitare la degradazione, raggiungere i loro bersagli molecolari ed esercitare le loro attività biologiche. È importante sottolineare che i CPP che trasportano un carico di macromolecole come una proteina solitamente entrano nelle cellule solo attraverso una via endocitotica/macropinocitotica14,15,16,17. Pertanto, lavori recenti si sono concentrati su CPP sintetici progettati razionalmente per ottenere internalizzazioni più efficienti, sia per facilitare le penetrazioni dirette o le fughe endosomali dei coniugati CPP-proteina sia per conferire resistenza alla degradazione proteolitica17,18,19,20,21. Oltre a questi recenti punti di riferimento, si prevede che diversi approcci per semplificare vari aspetti della metodologia miglioreranno la consegna pratica intracellulare di macromolecole biologiche. Inoltre, gli effetti dannosi derivanti dalle caratteristiche policationiche rimangono una questione critica da risolvere nei CPP canonici con struttura eupeptidica.